Frontières | Caractéristiques immunologiques de l'état inflammatoire dans la crise vaso-occlusive des patients drépanocytaires | Bracelet Yoga

introduction

L'anémie falciforme (ACS) est l'hémoglobinopathie la plus répandue dans le monde et la forme la plus grave d'un ensemble de troubles génétiques impliquant le gène de la -globine (1, 2). Elle est causée par la forme homozygote d'une mutation unique (adénine > thymine) sur le 17e nucléotide de la région 15,5 du bras long du chromosome 11, et entraîne la production d'une valine (au lieu de l'acide glutamique) et la formation d'une protéine tétramère connue comme l'hémoglobine S (HbS) (1, 3-7).

La mutation induit des altérations majeures de la structure des globules rouges (GR) secondaires à la polymérisation de l'HbS dans les zones de faibles tensions en oxygène (8). Ces altérations entraînent des modifications de l'interaction des globules rouges avec les plaquettes, les leucocytes et les cellules endothéliales, contribuent à la fois à la vaso-occlusion des petits capillaires et aux lésions d'ischémie-reperfusion, et entraînent une hémolyse chronique (1, 3). En conséquence, le SCA est considéré comme une maladie inflammatoire stérile chronique qui se produit par des lésions ischémiques qui contribuent au processus inflammatoire par la libération d'hémoglobine libre pendant l'hémolyse des globules rouges, en plus d'autres modèles moléculaires associés aux dommages (DAMP), tels que l'hème et le HMGB1. Cela conduit à un stimulus de TLR4 et favorise en outre une inflammation chronique et stérile, l'adhésion des cellules immunitaires et le processus de vaso-occlusion. La réponse cellulaire à ce stimulus chronique contribue à l'activation des neutrophiles, des monocytes, des mastocytes, des cellules endothéliales, des cellules dendritiques et des cellules NK, qui sont tous régulés par des niveaux de médiateurs inflammatoires principalement dirigés par des molécules immunologiques (1, 8-14 ).

Bien qu'elle soit causée par une seule mutation, la présentation clinique de l'ACS est modulée par la manière dont le système immunitaire réagit à l'hémolyse chronique et aux lésions d'ischémie-reperfusion. De plus, la maladie est caractérisée par des lésions organiques progressives chroniques pendant des périodes connues sous le nom d'état d'équilibre (StSt), intercalées avec des épisodes aigus de vaso-occlusion, appelés COV, qui sont considérés comme des exacerbations de l'état pro-inflammatoire du SCA avec formation supplémentaire de SCA. s'agrège avec les cellules immunitaires, les globules rouges falciformes et les plaquettes (1, 8-10).

Le taux global est lié à l'augmentation du risque de COV, et les conséquences de celui-ci incluent des lésions tissulaires, une hypoxie, une ischémie-reperfusion, un dysfonctionnement rénal, un syndrome thoracique aigu, un accident vasculaire cérébral et, enfin, une diminution de l'espérance de vie du patient (3, 8 , 10, 11, 15, 16). Même si de nombreuses études ont analysé les schémas immunologiques dans les SCA (17-21), la relation entre ces molécules et le statut inflammatoire des COV et la présentation clinique, il existe encore des lacunes dans les connaissances.

Cette étude visait à évaluer si et à quel point les cytokines, les chimiokines, les anaphylatoxines et les facteurs de croissance sont des caractéristiques de l'état inflammatoire pour les patients atteints d'ACS dans différentes conditions cliniques traitées dans un hôpital de référence hématologique en Amazonie brésilienne. Nous montrons ici que même après récupération clinique des COV, les patients SCA présentaient toujours une concentration plus élevée de médiateurs pro-inflammatoires.

Matériels et méthodes

Déclaration d'éthique

La présente étude a été soumise et approuvée par le comité d'éthique de la Fundação Hospitalar de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas (CEP-HEMOAM), via les processus #1.864.640 et #2.478.469. Tous les participants inscrits à la présente enquête ont lu et signé le formulaire de consentement éclairé conformément à la Déclaration d'Helsinki et à la Résolution 466/2012 du Conseil national brésilien de la santé pour la recherche impliquant des sujets humains.

Sujets et échantillons

Des échantillons de sang total ont été prélevés par ponction veineuse auprès de 53 donneurs sains (HD) éligibles au don de sang et n'ayant aucune maladie infectieuse ou génétique. Des échantillons ont également été collectés auprès de 27 patients atteints d'ACS à l'état d'équilibre (StSt) (défini comme l'absence de symptômes cliniques associés aux COV), qui n'avaient pas reçu de transfusion sanguine dans les 90 jours précédant le recrutement et avaient des tests sérologiques négatifs. pour le VIH, le VHC, le VHB, le HTLV et la syphilis. De plus, des échantillons ont également été obtenus auprès de 22 patients atteints d'ACS en COV (caractérisés par des douleurs aiguës localisées au niveau lombaire, de la hanche, des os, des articulations ou abdominales sans autre cause), ce qui avait été confirmé par les professionnels de santé de l'HEMOAM ; l'hôpital de référence de l'état d'Amazonas pour le traitement des patients atteints de maladies hématologiques. Un échantillon de sang supplémentaire a été obtenu auprès des patients du groupe COV, dans la période entre la sortie des patients et leur première visite ambulatoire, dans les 90 jours suivant l'inscription. Ces échantillons ont été identifiés comme le groupe de convalescence (CV). Les données cliniques et épidémiologiques ont été obtenues à partir des dossiers médicaux. En ce qui concerne le traitement, les médicaments suivants ont été enregistrés : acide folique, hydroxyurée, analgésiques, corticoïdes et anti-inflammatoires pendant plus d'un an avant le prélèvement des échantillons.

De tous les donneurs et patients sains, 8 ml de sang total ont été prélevés et divisés également dans de l'EDTA (BD Vacutainer® Tubes EDTA K2) et Séparateur Gel (Gel BD SST® II Advance) tubes. Du sang total dans des tubes EDTA a été utilisé pour l'acquisition de données hématologiques pour les globules rouges (GR), les globules blancs (WBC) et les plaquettes, qui ont été obtenues à l'aide d'un compteur hématologique automatique (ADVIA 2120i, Siemens, USA) à HEMOAM. En utilisant la centrifugation, le sérum a été obtenu à partir des tubes avec un gel séparateur et a ensuite été stocké à -80°C jusqu'à d'autres dosages.

Quantification des molécules immunologiques

Le sérum a été utilisé pour quantifier les chimiokines (CXCL8, CXCL10, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5 et CCL11), les cytokines (IL-1β, IL-1ra, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL -7, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-17A, IFN-γ et TNF-α) et des facteurs de croissance (G-CSF, GM-CSF, PDGF-BB, VEGF et FGF Basic ( FGFb)), et a été réalisée en utilisant la technique Luminex à l'Instituto René Rachou (FIOCRUZ-MG). Le kit Bioplex-Pro Human Cytokine 27-Plex (Bio-Rad, Californie, USA) a été utilisé en suivant les instructions et le protocole du fabricant. L'acquisition des données et les niveaux de molécules ont été mesurés sur un système Luminex 200 et un logiciel Bioplex Manager, respectivement, en utilisant la régression logistique à cinq paramètres, avec des résultats exprimés en pg/ml. La limite de détection des molécules est la suivante : CXCL8 = 42 150 pg/ml ; CXCL10 = 31 236 pg/ml; CCL2 = 24 282 pg/ml; CCL3 = 960 pg/ml; CCL4 = 11 233 pg/ml; PDGF-BB = 24 721 pg/ml, CCL5 = 16 533 pg/ml; CCL11 = 26 842 ; IL-1β = 8 608 pg/ml; IL-1ra = 91 661 pg/ml; IL-2 = 18 297 pg/ml; IL-4 = 4 789 pg/ml; IL-5 = 23 105 pg/ml; IL-6 = 37 680 pg/ml; IL-7 = 16 593 pg/ml; IL-10 = 35 170 pg/ml; IL-12p70 = 37 684 pg/ml; IL-13 = 8 090 pg/ml; IL-17A = 28 850 pg/ml; IFN-y = 25 411 pg/ml; TNF-a = 64 803 pg/ml; FGFb = 16 046 pg/ml; G-CSF = 40 049 pg/ml; GM-CSF = 12 844 pg/ml; et VEGF = 29 464 pg/ml. En raison de problèmes d'analyse des billes, les niveaux d'IL-9 et d'IL-15 n'ont pas pu être effectués. De plus, la quantification des anaphylatoxines C3a, C4a et C5a a été réalisée à l'aide d'échantillons de plasma EDTA avec le kit BD™ CBA (Cytometric Bead Array) Human Anaphylatoxin kit (BD® Biosciences, San Diego, Californie, États-Unis). Un cytomètre en flux FACSCanto II a été utilisé pour l'acquisition des échantillons. L'analyse de la concentration des molécules d'anaphylatoxine a été réalisée à l'aide du logiciel FCAP-Array v.3 (Soft Flow Inc., USA). Les limites de détection sont les suivantes : C3a = 0,45 pg/ml ; C4a = 0,70 pg/ml; C5a = 1,15 pg/ml.

Analyses statistiques

L'analyse des données et les graphiques ont été réalisés à l'aide du logiciel GraphPad Prism v.5.0 (San Diego, CA, USA). Le test de normalité de Shapiro-Wilk a été réalisé pour l'analyse de la distribution de la normalité et l'acquisition de la médiane et (25e et 75e). Les données épidémiologiques ont été comparées pour les groupes à l'aide du test du Chi carré (χ2). La médiane des paramètres hématologiques et des niveaux de molécules a été utilisée pour la comparaison de HD, StSt et COV en utilisant le test de Kruskal-Wallis, suivi du test de comparaison multiple de Dunn. Pour la comparaison des groupes COV et CV, le test de paires appariées de Wilcoxon a été utilisé. UNE p– une valeur < 0,05 a été considérée comme significative pour tous les tests statistiques.

Signature de Molécules Immunologiques

La médiane de chaque molécule pour les groupes HD, StSt et COV a été calculée, comme décrit précédemment (22), et utilisée comme point de coupure. Ceci a été exprimé en pg/ml (CXCL8 = 2,64 ; PDGF-BB = 292,0 ; CCL3 = 0,96 ; CCL4 = 10,74 ; CCL2 = 9,07 ; CCL5 = 57,0 ; IL-1β = 1,12 ; IL-1ra = 29,11 ; TNF-α = 12,12; IL-6 = 1,12; IL-7 = 2,82; IL-12p70 = 2,40; IL-2 = 0,44; IFN-γ = 15,85; IL-4 = 0,53; IL-5 = 2,93; IL-13 = 0,70; IL-17A = 6,74; IL-10 = 5,20; CXCL10 = 69,68; VEGF = 9,08; GM-CSF = 7,81; G-CSF = 1,24; FGFb = 3,64; CCL11 = 23,14; C3a = 10,03; C4a = 7,61; C5a = 316.9). Cette valeur a été utilisée pour classer les patients de chaque groupe comme étant des producteurs de molécules « élevés » ou « bas ». La valeur en pourcentage a été obtenue et présentée dans un diagramme de Venn lorsqu'elle est supérieure au 50e centile, et obtenue à l'aide d'un site Web public (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/).

Réseau de marques immunologiques

L'analyse de corrélation a été réalisée à l'aide du test de Spearman dans le logiciel GraphPad Prism v.5.0 (San Diego, CA, États-Unis), et a utilisé toutes les molécules et paramètres des cellules sanguines pour chaque groupe. Les données ont été transférées sur une feuille de calcul (Microsoft Excel 2010), et le réseau de cytokines a été visualisé sur le logiciel en libre accès Cytoscape v.3.7.2. Pour tous les réseaux, chaque paramètre était représenté par un nœud circulaire, tandis qu'une corrélation significative était représentée par une ligne reliant les deux nœuds corrélés. Valeurs absolues de l'indice de corrélation (r) a été utilisé afin de classer la force de corrélation comme faible (r < 0), modéré (r ≥ 0,36 et ≤ 0,68), ou fort (r > 0,68), qui est représenté par l'épaisseur de la ligne, tandis que la corrélation positive et négative était représentée par des lignes continues et en pointillés, respectivement, comme proposé précédemment (23).

Analyse de la carte thermique et de l'arbre de décision

Les analyses de carte thermique ont été effectuées en utilisant les niveaux de concentration sérique de chaque biomarqueur évalués à l'aide de la fonction heatmap.2 dans le logiciel R (Project for Statistical Computing Version 3.0.1) et le package gplots. Les arbres de décision ont été construits à l'aide du logiciel WEKA (Waikato Environment for Knowledge Analysis, version 3.6.11, Université de Waikato, Nouvelle-Zélande) afin de classer les patients SCA en fonction de marqueurs immunologiques. Une validation croisée (LOOCV) a été appliquée afin d'estimer la précision de la classification et de tester la généralisabilité du modèle.

Résultats

Données épidémiologiques et de laboratoire

Les patients atteints d'ACS présentaient un âge médian de 22 ans dans les groupes StSt et COV, tandis que l'âge médian du groupe témoin était de 30 ans (p = 0,0324). Les hommes étaient le sexe majoritaire dans le groupe HD (70 %), tandis que les femmes étaient majoritaires dans le groupe StSt (67 %). Les données concernant le lieu de résidence et le traitement pharmacologique chronique sont décrites dans le tableau 1.


Tableau 1. Données épidémiologiques des patients HD et SCA, montrant l'âge, le sexe, la ville de résidence et le traitement pharmacologique chronique.

Les valeurs hématologiques de chaque groupe, les médianes et les résultats de l'analyse statistique sont décrits dans le tableau 2. Les patients de StSt avaient des taux de globules rouges, d'hémoglobine et d'hématocrite inférieurs à ceux des donneurs sains. De plus, les patients atteints de SCA (à la fois StSt et VOC) ont montré des niveaux accrus de réticulocytes. Le groupe COV était marqué par des numérations de globules blancs plus élevées, qui semblent être dues à l'implication des neutrophiles et des monocytes, bien que seul le taux de neutrophiles soit statistiquement plus bas après la crise. Les niveaux de basophiles ont diminué dans les conditions de StSt à COV, mais aucune différence significative n'a été observée dans les conditions de COV et de la phase de convalescence. Même si le taux de plaquettes n'avait pas de différence statistique chez les patients SCA, il était plus élevé que dans le groupe HD. Les patients atteints d'ACS, quel que soit leur état inflammatoire, présentaient une implication plus élevée des lymphocytes et des plaquettes.


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Tableau 2. Données de laboratoire des paramètres hématologiques des groupes HD, StSt, COV et CV.

SCA est marqué par un profil de molécule inflammatoire indépendamment de l'état clinique

Dans le but de caractériser le profil des biomarqueurs sériques chez les patients SCA, une gamme de médiateurs solubles a été quantifiée dans les groupes StSt, COV et comparée au groupe HD. Des niveaux significativement plus élevés de chimiokines (CXCL8, CXCL10, CCL3, CCL4, CCL5), de cytokines (IL-1β, IL-12p70, IL-17A, IL-10), de facteurs de croissance (VEGF et GM-CSF) et d'anaphylatoxine C4a ont été trouvés chez les patients SCA, par rapport au groupe HD, comme le montre la figure 1. Les chimiokines semblaient être plus impliquées dans les COV, par rapport à StSt, grâce à des niveaux accrus de CCL3, CCL5 et CCL11 (figure 1A). De plus, les niveaux d'IL-4 et d'IL-5 étaient plus élevés (figure 1B). L'état inflammatoire observé dans le groupe StSt était caractérisé par une concentration accrue des molécules pro-inflammatoires IL-1β, TNF-α, IL12p70, IFN-γ et IL-17A, malgré des taux circulants plus élevés d'IL-10, GM-CSF, C4a et C5a, par rapport au groupe COV (Figures 1A, C, D). De plus, dans notre analyse moléculaire, nous avons observé que les patients du groupe COV ont des valeurs médianes significativement plus élevées de marqueurs de prolifération cellulaire.


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Figure 1. Patients SCA en COV (Oui) montrent un profil de cytokine anti-inflammatoire, par rapport à StSt (Oui) et HD (Oui) groupes. Des valeurs statistiquement significatives ont été prises en compte lorsque p < 0,05, et sont présentés comme *p < 0,05 ; **p < 0,01 ; ***p < 0,001. Chimiokines (UNE), cytokines (B) et facteurs de croissance (C) ont été mesurés à l'aide de Luminex et d'anaphylatoxines (RÉ) mesuré à l'aide de l'ACB. Les données sont présentées sous forme de valeurs médianes et d'intervalles interquartiles en pg/ml. L'analyse statistique a été effectuée à l'aide du test de comparaison multiple de Kruskal-Wallis et Dunn. HD, donneurs sains ; StSt, régime permanent ; COV, crise vaso-occlusive.

Signature des molécules immunitaires présentées par les groupes HD, StSt et VOC

La figure 2 résume les signatures des biomarqueurs et présente le diagramme de Venn des molécules immunologiques, avec les intersections et les éléments respectifs pour les groupes HD, StSt et COV. Notre objectif était de décrire quel groupe a été classé comme étant le plus grand producteur de molécules, et qui appartiennent exclusivement à chaque groupe (figure 2A). L'état inflammatoire dans le groupe StSt a montré que la majorité des patients présentaient des niveaux accrus de 22 molécules immunitaires solubles, tandis que le groupe StSt présentait des producteurs supérieurs de seulement six : CCL2, IL-1β, IL-12p70, IFN-γ, IL-17A , et GM-CSF, sur la base de la majorité des patients et de la médiane globale (Figure 2B). Notre analyse n'a identifié aucune molécule que les trois groupes partagent en tant que producteurs élevés, cependant, les groupes HD et StSt ont tous deux montré une production plus élevée de TNF-α, C5a et IL-6, et les patients SCA, quel que soit leur état inflammatoire, se sont présentés comme producteurs supérieurs de 13 molécules immunitaires (figure 2B). Bien que 19 molécules aient été identifiées comme ayant une production plus élevée de COV, seulement six ont été montrées exclusivement à ce stade : IL-2, IL-7, IL-4, IL-5, PDGF-BB et G-CSF, ce qui suggère que le L'état des COV est orchestré non seulement par des cytokines anti-inflammatoires, mais également par une prolifération cellulaire intense (figure 2B).


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Figure 2. Molécules immunologiques dans l'état clinique des COV des patients SCA présentés dans un diagramme de Venn. (UNE) Biomarqueur ascendant Signature des groupes HD, StSt et COV en fonction de la fréquence des sujets avec des niveaux de biomarqueurs supérieurs au seuil. (B) Diagramme de Venn avec les groupes, intersections et éléments respectifs signalés comme caractéristiques potentielles. Les éléments décrivent quelles molécules sont des caractéristiques potentielles pour chaque état clinique et chaque contrôle. Les molécules ont été mesurées en utilisant Luminex et CBA. La médiane globale pour chaque molécule soluble a été calculée et utilisée comme point de coupure afin de classer les groupes comme faibles (<50%) or high (>50%) producteurs de chimiokines, cytokines, facteurs de croissance et anaphylatoxines. HD, donneurs sains ; StSt, en régime permanent ; COV, crise vaso-occlusive.

Potentiel des marqueurs immunologiques IL-1β, IL-10, IL-1ra et IL-6 pour distinguer les conditions cliniques (StSt, COV et CV) chez les patients atteints de SCA

L'analyse de la carte thermique a été réalisée avec les niveaux sériques des molécules immunitaires des patients SCA pour démontrer les composants utilisés dans le regroupement des sous-groupes StSt ou COV par rapport aux individus sains. Même si les histogrammes de la comparaison du groupe HD (barre supérieure jaune) avec le groupe SCA StSt (barre supérieure rouge) (figure 3A) et le groupe VOC (barre supérieure verte) (figure 3B) avaient un meilleur regroupement par rapport aux patients SCA , notre arbre d'analyse décisionnelle pour les sous-groupes SCA a mis en évidence les niveaux d'IL-10 et d'IL-1ra comme les principaux attributs pour caractériser les individus sains et les patients dans StSt en fonction du profil moléculaire, avec une précision globale de 100 %, qui a atteint 96 % après LOOCV (Figure 3C). L'analyse a montré que les niveaux circulants d'IL-10 lorsque ≤ 17,56 pg/ml indiquaient un groupe HD, tandis que lorsque > 17,56 pg/ml, une analyse supplémentaire a contribué à identifier HD si IL-1ra > 62,88 pg/ml ou StSt si IL-1ra 62,88 pg/ml (figure 3C). Afin de caractériser les groupes HD et COV, les niveaux de biomarqueurs sériques ont contribué à regrouper le groupe HD si IL-1β > 0,43 pg/ml ou COV si IL-1β ≤ 0,43 pg/ml avec une précision de 100 %, qui a atteint 98 % après LOOCV (Figure 3D). Dans les sous-groupes SCA, IL-1β peut également être utilisé pour catégoriser les patients StSt, lorsque > 0,43 pg/ml, ou si <0.43 pg/ml, a further analysis contribute to identify VOC if IL-6 >2,66 pg/ml ou CV si IL-6 2,66 pg/ml (Figure 3E).


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figure 3. Analyse bioinformatique des molécules sériques divisées en attributs du groupe témoin et des sous-groupes SCA en fonction de l'état clinique, représentées par des cartes thermiques (UN B) et arbres de décision (C–E) des événements normalisés par score z. (UNE) Les attributs de la molécule ont montré la capacité de regrouper des individus sains et des patients atteints d'un SCA à l'état d'équilibre. (B) L'analyse de la carte thermique montre également une grande capacité à distinguer les témoins et les patients SCA vaso-occlusifs. (C) L'analyse de l'arbre de décision fournit le regroupement basé sur les niveaux circulants d'IL-10 afin de classer les individus comme HD si ≤ 17,56 pg/ml ou si > 17,56 pg/ml, analyser le niveau d'IL-1ra pour catégoriser comme HD si > 62,88 pg/ml ou comme StSt si ≤ 62,88 pg/ml. (RÉ) L'analyse de l'arbre de décision fournit un regroupement des groupes HD et COV en fonction des niveaux circulants d'IL-1β afin de catégoriser les individus comme HD si > 0,43 pg/ml ou comme COV si ≤ 0,43 pg/ml. (E) L'analyse de l'arbre de décision permet de regrouper les patients atteints de SCA en fonction des niveaux circulants d'IL-1β afin de classer les individus comme StSt si > 0,43 pg/ml ou si ≤ 0,43 pg/ml, analyser le niveau d'IL-6 pour les classer comme COV si > 2,66 pg/ ml ou comme CV si ≤ 2,66 pg/ml. HD, donneurs sains ; StSt, en régime permanent ; COV, Crise vaso-occlusive ; CV, Convalescence; LOOCV, validation croisée Leave-One-Out.

Caractéristiques des molécules immunitaires chez les patients atteints de SCA aigu à chronique après COV

Un suivi a été effectué chez les patients pendant la condition de COV, qui a comparé les échantillons obtenus à l'admission et après la convalescence. En analysant les résultats obtenus, nous avons pu identifier les marqueurs les plus sensibles de la physiopathologie des SCA après récupération des COV. Le délai médian entre les prélèvements d'échantillons était de 53 jours. Cependant, nos résultats montrent que le profil inflammatoire n'a pas changé de manière significative. Les états COV et CV ont maintenu un profil immunologique similaire, à l'exception de CXCL8, CCL4, IL-1ra et PDGF-BB (Figures 4A-C). Même si CXCL8 et CCL4 avaient des niveaux de CV significativement inférieurs, aucune différence n'a été observée dans les valeurs médianes dans les groupes StSt et COV, qui étaient différentes de l'IL-1ra et du PDGF-BB. Comme le montrent les figures 1, 4, les caractéristiques de la transition aiguë à chronique peuvent être marquées par ces quatre molécules, bien que seuls IL-1ra et PDGF-BB aient montré des différences significatives dans les deux états.


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Figure 4. Analyse des premières molécules qui diminuent après crise, par rapport aux COV (Oui) et CV (Oui) groupes. L'analyse statistique a été réalisée à l'aide du test de Wilcoxon. UNE p-valeur < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative et a été présentée comme *p < 0,05 ; **p < 0,01. Chimiokines (UNE), cytokines (B), et les facteurs de croissance (C) ont été mesurés à l'aide de Luminex et d'anaphylatoxines (RÉ) en utilisant l'ABC. Les données sont présentées sous forme de valeurs médianes et d'intervalles interquartiles, en utilisant les données en pg/ml. COV, Crise vaso-occlusive ; CV, Convalescence.

Les patients atteints de SCA présentent un réseau de corrélation complexe avec une implication différente dans les molécules immunitaires en fonction de l'état inflammatoire

Bien que la fonction de la plupart des molécules immunitaires soit déjà connue, l'analyse de corrélation nous permet d'observer l'interaction entre les groupes. Ainsi, nous avons observé que l'analyse de corrélation dans le groupe HD et les patients SCA StSt et VOC avaient des schémas différents. Alors que les patients StSt ont moins d'interactions, une maladie inflammatoire chronique médiée par les monocytes, entraînée par IL-17A, IL-12p70, CXCL10 et CCL4 (Figure 5B) peut être observée par rapport au groupe HD (Figure 5A). En revanche, le groupe COV présentait une augmentation des molécules de corrélation, qui a été mise en évidence par le schéma inflammatoire et polarisée à une réponse anti-inflammatoire, et a montré une interaction principale d'IL-1β, IL-2, IL-7, IL-4 , IL-5, IL-13, IL-17A, FGFb et GM-CSF (Figure 5C). Outre les corrélations fortes et positives observées, le GM-CSF et l'IL-1ra présentaient une corrélation forte mais négative. Le réseau du groupe CV avait un indice de corrélation plus faible (figure 5D), bien que les molécules décrites dans les COV semblaient toujours avoir une participation plus élevée au processus d'inflammation aiguë à chronique.


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Figure 5. Analyse de corrélation présentée comme un réseau de cytokines immunologiques, de chimiokines, de facteurs de croissance, d'anaphylatoxines et de leucocytes chez des donneurs sains (UNE), régime permanent (B) crise vaso-occlusive (C), et convalescence (RÉ) étapes. Chaque paramètre est affiché dans un nœud. L'analyse statistique a été réalisée en utilisant le test de corrélation de Spearman et les corrélations significatives (p < 0,05) sont représentés par une ligne reliant les deux nœuds. La corrélation a été classée comme faible (r < 0), modéré (0,36 < r < 0,68) et fort (r > 0,68), basé sur la valeur absolue de l'indice de corrélation r, représenté par l'épaisseur du trait. La corrélation positive est exprimée par une ligne continue, tandis que la corrélation négative par des lignes pointillées. NEU, neutrophiles; LYMP, Lymphocytes; MON, monocytes; EOS, éosinophiles; BAS, basophiles; PLT, plaquettes ; MPV, volume plaquettaire moyen ; chimiokines (CXCL8; CXCL10; CCL3; CCL4; CCL2; CCL5; CCL11), cytokines (IL-1β; IL-1ra; IL-6; TNF-α; IL-12p70; IFN-γ; IL-2; IL-7 ; IL-4 ; IL-5 ; IL-13 ; IL-17A ; IL-10), des facteurs de croissance (VEGF ; FGFb ; PDGF ; GM-CSF ; G-CSF) et des anaphylatoxines (C3a ; C4a ; C5a). HD, Donneurs sains ; StSt, régime permanent ; COV, crise vaso-occlusive ; CV, convalescence.

Les matrices de corrélation corroborent davantage ces résultats et soulignent que tandis que HD (Figure 6A) affichait un réseau caractéristique avec une connectivité globale modérée et que le groupe StSt (Figure 6B) présentait un réseau panoramique avec moins de connexions de voisinage, les patients VOC présentaient un niveau plus élevé d'immunité. connectivité des marqueurs, en particulier dans l'axe des cytokines (figure 6C). Au fur et à mesure que le groupe COV se déplace vers le groupe CV (figure 6D), une nette régulation à la baisse de la connectivité des biomarqueurs peut être observée.


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Figure 6. Les matrices de corrélation des biomarqueurs illustrent des modèles distincts de connectivité des biomarqueurs chez les donneurs sains (UNE), régime permanent (B), crise vaso-occlusive (C) et convalescence (RÉ) étapes. Les réseaux de biomarqueurs étaient basés sur les indices de corrélation de Spearman (r). Les matrices de corrélation affichent une association significative (p < 0,05) entre les paires de biomarqueurs sur la base des indices de classement, qui sont marqués par des clés de couleur, allant de -1,0 à 1,0 pour souligner la force de la corrélation, selon la clé de couleur fournie dans la figure. NEU, neutrophiles; LYMP, Lymphocytes; MON, monocytes; EOS, éosinophiles; BAS, basophiles; PLT, plaquettes ; MPV, volume plaquettaire moyen ; chimiokines (CXCL8; CXCL10; CCL3; CCL4; CCL2; CCL5; CCL11), cytokines ((IL-1β; IL-1ra; IL-6; TNF-α; IL-12p70; IFN-γ; IL-2; IL- 7 ; IL-4 ; IL-5 ; IL-13 ; IL-17A ; IL-10), facteurs de croissance (VEGF ; FGFb ; PDGF ; GM-CSF ; G-CSF) et anaphylatoxines (C3a ; C4a ; C5a) HD, donneurs sains ; StSt, état d'équilibre ; COV, crise vaso-occlusive ; CV, convalescence.

Discussion

L'ACS est marquée par une inflammation intense secondaire à une lésion systémique et à l'état clinique. Le processus inflammatoire est mis en évidence par plusieurs interactions de cellules, telles que les neutrophiles, les monocytes, les plaquettes et les globules rouges, qui sont impliquées dans la pathogenèse de cette maladie. En conséquence, les molécules immunologiques, en particulier les cytokines, les chimiokines, les facteurs de croissance et les anaphylatoxines sont également pertinentes en tant que régulateurs de ce processus. Bien que plusieurs études aient évalué les niveaux de ces molécules et leur association avec les caractéristiques cliniques du SCA, peu de preuves sont disponibles concernant l'interaction de ces molécules chez les individus atteints de SCA, en particulier pendant les COV et lors de la transition de l'état aigu à l'état chronique. après un COV. La principale conclusion de notre étude était la capacité d'utiliser les niveaux d'IL-1β, IL-10 et IL-1ra pour séparer les sous-groupes de patients atteints d'ACS.

Les patients de StSt ont une gravité moindre de la maladie et ne présentent aucun symptôme clinique menaçant, par rapport aux patients en crise. Même sans symptômes graves, les marqueurs inflammatoires sont toujours présents, par rapport aux témoins sains. De plus, ces molécules sont impliquées dans la réponse immunitaire qui contribue aux épisodes de vaso-occlusion (3, 8, 24). L'inflammation chronique dans StSt semble être caractérisée par des niveaux accrus dans les cytokines pro-inflammatoires IL-1β, TNF-α, IL-12p70, IFN-γ et les cellules circulantes mais avec moins d'implication endothéliale, de manière similaire à ce qui a été observé dans d'autres études (18, 25-28). Il a déjà été établi que les neutrophiles, les monocytes et les molécules pro-inflammatoires, ainsi que les plaquettes, jouent un rôle important dans la gravité de la maladie (3, 9, 26, 29). Des niveaux accrus d'IL-10 dans la StSt ont été décrits dans le cadre de la différenciation des lymphocytes T (30), du développement des COV et de la gravité de la maladie (31), suggérant que cette cytokine participe au processus de régulation de l'état pro-inflammatoire. De plus, d'autres facteurs, tels que des maladies infectieuses ou d'autres maladies génétiques, influencent la réponse inflammatoire et contribuent à la vaso-occlusion, réduisant ainsi l'espérance de vie du patient (1, 10).

L'inflammation aiguë est caractérisée par une ischémie/une lésion de reperfusion locale, un recrutement de leucocytes et une activation des cellules circulantes, qui contribuent à des symptômes cliniques sévères dans un COV (3, 8). Certaines études décrivent la participation de cytokines anti-inflammatoires dans cette affection (8, 20, 24, 30) et, de plus, nos résultats montrent qu'elle est marquée principalement par les molécules IL-1ra et IL-4, avec implication des neutrophiles adhérents et monocytes. De nombreuses études se sont concentrées sur les différences de niveaux de molécules dans StSt et COV (17-19, 32), Cependant, peu d'études se sont concentrées sur les caractéristiques immunologiques, qui peuvent être utilisées pour décrire la transition entre les états inflammatoires (StSt, COV et convalescence). Des niveaux accrus d'IL-2 et d'IL-7, ainsi que des facteurs de croissance, ont été précédemment observés (20) et contribuent à la prolifération et à la maturation des granulocytes. De plus, les découvertes concernant les chimiokines appuient l'affirmation selon laquelle ces cellules circulantes montrent une plus grande capacité à adhérer aux cellules endothéliales et à former des agrégats de cellule à cellule et de cellule-endothélium dans les COV, ce qui contribue aux lésions endothéliales, à la production de marqueurs inflammatoires, aux cellules immunitaires. recrutement, vaso-occlusion et par conséquent complications cliniques sévères, telles que décrites par d'autres auteurs (3, 10, 29, 30, 33). Nos données ont démontré que les patients VOC présentaient un manque de facteurs pro-inflammatoires canoniques et une nette augmentation des médiateurs régulateurs. Cela peut suggérer que les COV ne sont pas une condition anti-inflammatoire en soi, mais cela peut être lié à un biais dans le « type » d'inflammation plutôt qu'à son ampleur/force. L'analyse des réseaux de biomarqueurs et des matrices de corrélation entre les paires de médiateurs solubles a démontré qu'il existe une forte connectivité entre les cytokines pro-inflammatoires/régulatrices dans les COV. La force des connexions IL-1β dans les COV était remarquable et peut suggérer que l'activation de l'inflammasome peut participer à la physiopathologie de l'ACS.

Nous avons identifié que la voie alternative du système du complément n'est pas si différente sous StSt ou VOC, contrairement à ce qui a été décrit par d'autres auteurs. L'IL-1β et l'IL-17A pourraient être indirectement liés à l'activation classique du système du complément par la production de protéine C-réactive (CRP) à partir du foie (32, 34-36), et d'autres interactions avec des anticorps naturels (37), aboutissant à taux de clivage C4 plus élevé. L'hème libre interagit avec les ligands C1q (CRP et immunoglobuline) et conduit à une activation moins classique du complément dans les COV (38); et avec C3, culminant sur un taux de clivage C3 plus élevé (39, 40). La disponibilité de l'hème libre et son interaction directe et indirecte avec les molécules complémentaires peuvent expliquer pourquoi les groupes SCA n'avaient pas de différence significative dans les niveaux de C3a. Cette activation accrue de la voie du complément a déjà été décrite chez les patients StSt et observée dans nos résultats (41). Peu d'informations relatives à l'implication du système du complément dans le SCA sont disponibles, mais même si la production d'anaphylatoxines est bien définie, la fonction des anaphylatoxines en tant que molécules inflammatoires ou régulatrices reste incertaine dans la physiopathologie du SCA.

Étonnamment, les groupes HD et StSt ont été identifiés comme des producteurs plus élevés des molécules pro-inflammatoires TNF-α et IL-6, bien que seuls les niveaux de TNF-α soient significativement plus élevés dans les COV, mais pas dans l'IL-6, comme observé dans certaines études ( 18, 27, 28) et contrairement aux autres (17, 20, 32, 36, 42-44). Les COV ont été caractérisés comme étant un plus grand producteur de cytokines anti-inflammatoires et de prolifération des cellules immunitaires. Il est important de noter que l'IL-4 et l'IL-5 sont également produites par les mastocytes activés, qui ont été signalés lors de COV chez la souris, et contribuent de manière importante à la douleur (14). Même si des niveaux plus élevés de certaines cytokines ont été décrits par d'autres auteurs, cette caractérisation n'a jamais été décrite auparavant pour les patients atteints de SCA.

De manière complémentaire, notre analyse bioinformatique a permis la ségrégation des patients atteints d'ACS sur la base des taux circulants d'IL-1β, IL-10, IL-1ra et IL-6, et quel que soit leur rôle, nous avons décrit ces molécules comme des marqueurs potentiels pour la ségrégation de ces patients en Groupes StSt, COV et CV. Les arbres de décision montrent de nouvelles propositions de biomarqueurs qui devraient être étudiées dans d'autres études pour une meilleure compréhension de la physiopathologie des SCA et peuvent ainsi contribuer à de meilleures décisions cliniques.

The CV group was an intermediary period in VOC and StSt stages, for which we observed that the first inflammatory mediators to decrease were CXCL8, CCL4, IL-1ra, and PDGF-BB after hospital release after a VOC episode. However, only IL-1ra and PDGF-BB presented statistical differences in VOC and StSt groups. Even though IL-1ra is known to be an anti-inflammatory marker, its concentration was related to increased events of pain (45). As such, we believe that these results may contribute to the SCA patient's follow-up after treatment for VOC episodes. In addition, the correlations allowed us to identify that, during this acute-to-chronic transition, some interactions in the main molecules responsible for cell proliferation still remain, which indicates that there still is stimulus for leukocytosis, even though the inflammation pattern does not differ that much from VOC.

A strong and positive correlation under TNF-α and GM-CSF in VOC was identified in our analysis, which sustains a positive inflammatory pattern, with further leukocyte recruitment and activation, especially neutrophils and monocytes (9, 33). Negative feedback is observed in both StSt and VOC conditions, the first is mediated by IL-10, while the second by IL-1ra, which is an inactive antagonist of IL-1β. This statement is supported by the IL-10/CXCL10 and IL-1ra/GM-CSF axis in StSt and VOC, respectively. IL-10's role as a biomarker in SCA is still controversial, since some authors describe lower levels in StSt, when compared to the control group, together with CXCL10 (43), while others found increased levels (20, 30, 46, 47) and some show no difference (17).

The present study has some limitations. Since SCA is considered a sterile inflammatory disease, the assessment of the TLRs expression, as well as the analysis of checkpoints in immune cell subsets along with quantification of other cytokines (IL-1a, IL-18, and IL-33), would provide a more detailed description regarding the inflammasome activation in order to more fully understand SCA pathophysiology and allow for the identification of novel prognostic factors. These aspects remain to be elucidated in future investigations.

Our study brought new perspectives for inflammatory knowledge of SCA. In fact, the role of many molecules in SCA is still discussable whether inflammatory or regulatory, as well as their association to a VOC development or as a consequence of a VOC.

Conclusion

Herein, we highlight the interactions of IL-4 and IL-2 cytokines in VOC, as well as the efficacy of IL-1ra and PDGF-BB as markers of clinical recovery post-VOC. In addition, we describe the ability of IL-10 and IL-1ra levels to cluster patients into HD or StSt, and IL-1β levels to cluster patients into HD or VOC. Our results contribute to novel markers in the Brazilian Amazon SCA population, and suggest their potential in prognosis and follow-up after hospital recovery from VOC. The present study is the first report on inflammatory hallmarks in VOC and CV in sickle cell anemia patients and supports greater understanding of disease pathophysiology mechanisms in order to identify novel inflammatory biomarkers and contribute to therapeutic perspectives.

Data Availability Statement

The original contributions presented in the study are included in the article/supplementary material, further inquiries can be directed to the corresponding author/s.

Ethics Statement

The studies involving human participants were reviewed and approved by the Ethical Committee at Fundação Hospitalar de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas (CEP-HEMOAM), via the processes #1.864.640 and #2.478.469. All participants enrolled in the present investigation read and signed the informed consent form in accordance with the Declaration of Helsinki and Resolution 466/2012 of the Brazilian National Health Council for research involving human subjects. The patients/participants provided their written informed consent to participate in this study.

Author Contributions

AS-J, AC, and AM designed, performed the experiments, analyzed data, and wrote the manuscript. AS-J, MG, LA, OM-F, and AC analyzed data. AS-J, NG, EC, SD, and AT recruited all individuals, performed the experiments, and revised the manuscript. NF, AT-C, and ED revised the manuscript. AS-J, NG, AT, OM-F, AT-C, and AM supervised the project development, designed the experiments, interpreted the data, wrote, and revised the manuscript. All authors read and approved the final manuscript.

Funding

This study was funded by Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) (Pró-Estado Program—#002/2008, #007/2018, and #005/2019, PAMEQ Program—#004/2019 and PAPAC Program—#005/2019), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) (PROCAD-Amazônia 2018 Program—#88881.200581/2018-01). AS-J, EC, SD had fellowship from CAPES and FAPEAM (PhD, Master and SI students). OM-F was level 1 research fellow from CNPq and a research fellow from FAPEAM (PVN-II, Pró-Estado Program—#002/2008, #007/2018 and #005/2019). AT-C and AM were level 2 research fellows from CNPq. The funders had no participation in study design, sample and data collection, analysis and manuscript development.

Conflict of Interest

The authors declare that the research was conducted in the absence of any commercial or financial relationships that could be construed as a potential conflict of interest.

Acknowledgments

The authors also thank the Program for Technological Development in Tools for Health (PDTIS-FIOCRUZ) for the use of its facilities and Flow Cytometry Platform at HEMOAM. We are grateful to Grupo Integrado de Pesquisas em Biomarcadores at Instituto René Rachou, Fundação Oswaldo Cruz of Minas Gerais state (FIOCRUZ-MG) for excellent technical assistance and support with the assays (collaboration of the technical assistants Ana Carolina Campi-Azevedo and Elaine Spezziali).

References

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